剛剛，華裔科學家劉如謙團隊再發Nature：邁向AI蛋白質工程通用範式

華裔科學家、哈佛大學教授劉如謙（David R.Liu）團隊近日再度於《自然》（Nature）期刊發表重磅成果。研究團隊證明，將人工智慧（AI）驅動的蛋白質序列重新設計，與實驗室連續進化技術相結合，能夠成功獲得針對非天然靶點、同時具備高穩定性、高催化效率與高特異性的新型蛋白酶。這項工作被認為有望成為蛋白質工程領域的通用範式，大幅加速新酶、治療性蛋白以及其他功能蛋白的開發進程。過去，科學家通常直接以天然酶作為定向進化的起點，但天然酶本身的穩定性往往有限；而經過人工改造或實驗室進化獲得的蛋白質，又常面臨穩定性、催化活性或特異性不足的困境。

劉如謙團隊提出的新策略，是先透過計算設計獲得穩定度更高的蛋白酶變體，再將這些設計好的蛋白酶作為自動化連續進化的起點，篩選能夠切割全新底物的變體。這套「先設計穩定性，再進化功能」的工作流程，為蛋白質科學開闢了全新的路徑。研究團隊以肉毒桿菌神經毒素血清型E（BoNT/E）為模型，使用AI蛋白質設計模型ProteinMPNN對其進行序列重新設計。他們保留底物識別與催化所需的關鍵殘基，其餘位點則由AI重新生成，並以AlphaFold2評估預測結構。隨後，團隊對AI設計變體進行表達、純化與活性測試。

結果顯示，多數AI設計變體都能切割天然底物SNAP25，其中D1、D2與D3三個變體的綜合表現最為突出，最高催化效率達到野生型酶的2.8倍。為了驗證結果是否依賴於特定模型，團隊也使用PROSS方法重新設計BoNT/E，同樣獲得表達、穩定性與酶動力學改善的變體。這套流程也成功拓展到其他BoNT蛋白酶，包括BoNT/F與BoNT/X，均保留或提高了催化效率。獲得穩定化變體後，研究團隊進一步比較AI設計變體D3與天然酶作為進化起點的適用性。他們讓兩類起點分別適應三個難度逐步增加的新底物（編號415、413與412），並使用噬菌體輔助連續進化（PACE）技術持續篩選更高活性的變體。

結果顯示，AI設計變體在所有三個新底物上都獲得更高的活性，特別是在最難的底物412上，D3的進化成功率遠高於天然酶。天然酶在四組實驗中僅有兩組獲得有效變體，而D3四組全部成功；D3變體的PACE迴路激活達到16至20倍，明顯優於天然酶變體的約10倍。突變互換實驗進一步揭示，部分有益突變僅在AI設計背景下有效，無法直接移植到天然酶中。AI重新設計不僅能提升新底物進化的效率，還能夠改善已有進化蛋白酶的表達與穩定性。研究團隊過去曾獲得一個針對PTEN蛋白的切割變體E(4130)A2，但該變體表達量低且穩定性差。

透過將該變體中的進化突變移植到AI重新設計的D1、D2與D3背景中，新蛋白酶不僅保留了PTEN切割能力，也不會重新切割天然底物SNAP25，同時表達量大幅提升。在大腸桿菌中，移植後的變體表達量提高了2.2至5.2倍；在HEK293T細胞中，D2與D3變體的表達量更提高超過24倍，PTEN切割產物分別增加4.5倍與3.9倍。重新設計的起點還讓蛋白酶探索到不同於天然酶的突變組合。以底物413為例，D3在進化過程中富集了一些天然酶中較少出現的突變組合，顯示AI設計後的蛋白酶可以探索不同的功能序列空間。

團隊進一步測試了其他替代設計起點，包括ProteinMPNN設計的變體D4以及PROSS設計的變體PROSS1，結果顯示這些起點同樣能在三個新底物上通過PACE選擇，並形成不同的進化基因型。值得注意的是，D4的初始催化速度雖比天然酶低約20倍，但進化後仍獲得了與其他設計起點相當、甚至更高的活性。整體而言，三種重新設計起點所產生的進化變體，活性均優於天然酶起點。研究團隊還將這個方法應用於進化能切割ataxin-2蛋白的蛋白酶。ataxin-2是一種與神經退行性疾病相關的蛋白，BoNT/E原本無法切割它。團隊選擇其1181至1201位殘基作為新的切割區域，該區域與異常蛋白聚集有關。

透過PACE比較天然酶起點與序列重新設計起點的進化結果，發現後者產生的D3進化變體切割ataxin-2的速度更快，提高1.4至1.7倍；同時，這些變體完全沒有檢測到對天然底物SNAP25的切割。在HEK293T細胞中，序列重新設計起點得到的變體表達量更高，產生的ataxin-2切割產物更多，副產物也更少，展現出更強的特異性與應用潛力。儘管成果令人振奮，研究團隊也坦承這項方法仍有不足。首先，這項研究主要圍繞BoNT/E蛋白酶展開，該蛋白酶適合透過序列重新設計提高穩定性，且功能可在PACE中被篩選。類似優勢能否複製到其他蛋白，仍需要更多驗證。

其次，ataxin-2靶向蛋白酶目前仍處於工具酶與早期應用驗證階段，這類設計進化酶能否用於破壞致病性ataxin-2包涵體、進而改善神經退行性疾病相關表型，仍有待後續研究推進。最後，對於重新編程的蛋白酶來說，安全性是未來應用中的關鍵問題。在切割非天然靶標時，除了提高目標切割效率，還需要儘可能減少對天然底物的切割，並系統評估潛在脫靶效應、細胞毒性、遞送方式與免疫安全性。這項研究由劉如謙團隊主導，論文已於《自然》期刊上線。整合AI蛋白質設計與連續進化的策略，為蛋白質工程提供了一條可複製的通用路徑，未來有望廣泛應用於新酶開發、治療性蛋白設計以及合成生物學領域，推動蛋白質科學進入AI驅動的新時代。