剛剛，諾獎得主Doudna再發Science：AI設計蛋白質，超越自然演化

諾貝爾化學獎得主珍妮佛‧道納（Jennifer Doudna）率領的研究團隊，日前在頂尖期刊《科學》（Science）上發表了一項突破性成果。他們透過人工智慧設計蛋白質，成功創造出一種名為 SynTnpB 的新型基因編輯蛋白，其中部分變體的活性不僅與天然酶相當，甚至超越自然演化的產物。這項研究首次以實驗確定了 AI 設計的 RNA 引導核酸酶結構，為基因編輯工具的開發開闢了全新路徑。 目前 CRISPR-Cas 技術已經能夠精準編輯 DNA 或 RNA，但要設計出自然界中不存在、卻仍保有活性的 RNA 引導核酸酶，一直是極具挑戰的任務。現有的序列模型生成的酶大多與天然序列非常接近，而結構引導設計雖然能探索更大的序列空間，卻仍然難以在大幅改寫序列的同時保留原有功能。 不同於先前基於序列的生物語言模型，道納團隊提出了一種結合結構資訊與演化資訊的 AI 蛋白設計策略，目標是生成序列高度分化、但功能依然保留的 RNA 引導核酸酶。為了驗證這套策略，團隊選擇了體型較小的 RNA 引導核酸酶 TnpB 作為設計標的。他們首先利用 ESM 逆摺疊模型（ESM-IF1），根據 TnpB 的三維結構產生候選序列。AI 生成的序列雖然保留了 TnpB 的整體摺疊以及 RuvC 結構域中的 DED 催化三聯體，但也會改動部分 RNA 與 DNA 識別相關的殘基。 為了解決這個問題，團隊基於演化資訊建構了一套序列遮罩機制：當某個位置在演化上的保守性（Ci）或與核酸序列的共同演化耦合強度（σi）高於設定閾值時，該殘基便固定為野生型；其餘位置則交由 ESM-IF1 重新設計。完成序列設計後，他們利用細菌的 ccdB 毒素系統來篩選具有活性的變體——能夠切割毒素質體的 TnpB 變體，可以讓細菌存活下來。 在初步測試中，若僅用保守性限制進行全長設計，活性相當有限。因此團隊進一步將 TnpB 的兩個主要結構域分開測試：REC 結構域主要參與 DNA 識別，NUC 結構域則與 RNA 結合及催化功能相關。結果顯示 NUC 結構域較能忍受序列改變。基於這項發現，團隊同時採用保守性（Ci）與耦合強度（σi）雙條件限制，從 1,980 個 REC-NUC 組合中篩選出 9 個高活性且序列多樣性高的變體。 整體而言，這些 AI 設計的 SynTnpB 變體在細菌、植物與人類細胞中都能保留編輯活性，部分甚至超越天然酶。團隊將 9 個變體分別放入 HEK293T 人類細胞與擬南芥原生質體中測試，結果顯示多數變體的活性與野生型相當，其中 v1 與 v5 表現最為突出，最高編輯率可達 50%，約為野生型的 1.8 倍。在植物細胞實驗中，v1 也在多數測試目標上優於野生型。 從特異性來看，SynTnpB 變體保留了典型的 TTGAT TAM 偏好，但脫靶表現因變體而異。全基因組 Tn5 標籤化分析顯示，v1 的特異性與野生型相當，而 v5 與 v7 則偵測到較多的脫靶位點。進一步的生化表徵發現，編輯活性的差異不能單純歸因於表達量——西方墨點法結果顯示各變體的表達水平與編輯活性並不相關。以 v7 為例，其熱穩定性與野生型相當，並保留了較強的目標鏈切割活性，但切割反應速度較野生型略有減慢。 冷凍電鏡結構解析提供了更加深入的機制洞察。團隊選擇序列分化程度較高的 v7（與野生型序列一致性為 77%）進行結構分析，解析度達到 2.8 Å，並成功捕捉到兩種構象狀態：TAM 結合狀態以及 R-loop 形成狀態。在 TAM 結合狀態中，蛋白與 RNA 的構象與 ISDra2 TnpB 二元複合物相似，同時結合了 DNA，並在異源雙鏈的種子區形成單鹼基配對。AI 生成的 N4R 殘基與保守的「磷酸鎖」殘基 K84 共同穩定這個配對，形成一個先前在 TnpB 中從未被報導過的構象中間體。 在 R-loop 形成狀態中，重組 RNA 與目標 DNA 已形成較完整的配對結構。此時，AI 生成的殘基分布在 REC、NUC 與 lid 等多個區域，與這段 RNA-DNA 雙鏈形成接觸；同時，橋接螺旋仍保留了有助於雙鏈形成的彎折運動。這些結構結果首次以實驗證據說明了 AI 設計的殘基如何在不同構象狀態下穩定 RNA-DNA 界面。 儘管成果令人振奮，研究團隊也坦承目前的方法仍有幾項限制。例如 TnpB 的不同結構域對序列改變的耐受性差異很大，與 DNA 識別相關的 REC 結構域對替換較為敏感，而 RNA 結合與催化相關的 NUC 結構域則更能承受變化。未來需要進一步驗證這套模組化設計原則是否適用於其他多結構域蛋白。此外，序列遮罩依賴足夠豐富的演化資訊，對資料庫中序列的多樣性與代表性要求較高。若能取得更豐富、更均衡的蛋白-核酸配對數據，將有助於將此方法推廣到其他多狀態蛋白或核酸結合蛋白。最後，AI 生成殘基如何具體影響核酸結合與構象變化，仍需更深入的研究。團隊表示，這項工作中冷凍電鏡捕獲到的 TAM 結合構象中間體，很可能代表一種動力學中間態，也為未來研究 RNA 引導核酸酶的瞬時構象提供了重要的先例。結合生成式生物學與從頭設計方法，未來有望突破自然序列的界限，進一步擴展此類蛋白的功能與可設計空間。